在流體環(huán)境下細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn),該應(yīng)用描述了一種在流動(dòng)下的粘附試驗(yàn)，該試驗(yàn)旨在研究特定細(xì)胞表面分子的作用，以確定它們?cè)诩?xì)胞附著和粘附到其他細(xì)胞類型期間的潛在相互作用。

　　實(shí)驗(yàn)流程　　

　　1.準(zhǔn)備EOMA細(xì)胞稀釋液：根據(jù)制造商的說明，使用非酶細(xì)胞解離溶液分離先前培養(yǎng)的EOMA細(xì)胞。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Neubauerchamber）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在EC培養(yǎng)基中將細(xì)胞稀釋至1.2x106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度。　　

　　2.種入EOMA細(xì)胞：在3個(gè) µ-SlidesI0.6mmLuer（ibidi，80186）中加入150µlEOMA細(xì)胞稀釋液（每個(gè)µ-Slide1.75x105EOMA細(xì)胞），然后孵育3小時(shí)。

　　表1：實(shí)驗(yàn)設(shè)置

　　3.啟動(dòng)流量：播種三小時(shí)后，將2個(gè)µ-Slides連接到流體單元FU，使用總量2.7毫升EC培養(yǎng)基。在8.2mbar的壓力下將EOMA細(xì)胞表面的剪切應(yīng)力設(shè)置為0.5dyn/cm2。測(cè)量流速并使用兩個(gè)FU的平均值來計(jì)算校準(zhǔn)因子。提前孵育FU和連接的載玻片過夜。第三個(gè)帶有EOMA細(xì)胞的µ-Slide用作靜態(tài)控制。在沒有任何流動(dòng)的情況下孵育它過夜。

　　4.準(zhǔn)備MM細(xì)胞：根據(jù)制造商的方案，用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培養(yǎng)基（不含F(xiàn)CS）中染色6x105MM細(xì)胞。標(biāo)記后，離心細(xì)胞并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。

　　5.開始與MM細(xì)胞共培養(yǎng)：停止流動(dòng)并在無菌條件下從FU水庫(kù)中取出EC培養(yǎng)基。要開始共培養(yǎng)，將RPMI培養(yǎng)基（含10%FCS）和EC培養(yǎng)基以1:1的比例混合，并填充該混合物總體積為2.5ml，其中含有1.5x105MM注入兩個(gè)FU儲(chǔ)液罐。將FU重新連接到泵系統(tǒng)并繼續(xù)流動(dòng)24小時(shí)。

　　6.分子阻斷：將MM細(xì)胞添加到ECs后24小時(shí)，用100µg/ml抗體（載玻片 #2）或相應(yīng)的同種型對(duì)照（載玻片 #1）處理細(xì)胞，將它們直接添加到FU，無需更換介質(zhì)。將孵育保持在流動(dòng)狀態(tài)下24小時(shí)。

　　7.清洗和成像：從FU上斷開µ-Slides。用PBS清洗細(xì)胞一次，以去除任何非貼壁細(xì)胞。使用共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像，以可視化附著在EC層上的標(biāo)記MM細(xì)胞。

　　圖1：與同種型對(duì)照處理（左圖）相比，阻斷特定表面分子（右圖）時(shí)，MM細(xì)胞對(duì)ECs的粘附性降低